John Phillip Stamos – so sein bürgerlicher Name – wurde 1963 in Kalifornien als ältester von drei Geschwistern geboren. Er hat zwei jüngere Schwestern namens Janeen und Alaina, die beide als Lehrerinnen arbeiten. Der eigentliche Nachname der Familie lautete Stamotopoulos, aber als seine Großeltern aus Griechenland nach Amerika einwanderten, verkürzten sie diesen Namen auf Stamos.

Bekannt wurde John Stamos durch die US-Fernsehserie Full House, die zwischen 1987 und 1995 im Fernsehen lief. In dieser Serie spielte er den Charakter Jesse, der ebenfalls griechischer Herkunft war. In der ersten Staffel von Full House hatte Jesse den Nachnamen Cochran, aber die Produzenten der Serie beschlossen nach Johns Bitte den Nachnamen von Cochran auf Katsopolis zu ändern, um damit seine griechische Herkunft zu unterstreichen. Im richtigen Leben besitzt John Stamos eine sehr enge und gute Beziehung zu Mary-Kate Olsen und Ashley Olsen, die in der Serie Full House abwechselnd seine Nichte Michelle gespielt haben.

Am 19. September 1998 heiratete er Model und Schauspielerin Rebecca Romijn, die daraufhin den Doppelnamen Romijn-Stamos annahm. Die Ehe wurde jedoch am 1. März 2005 wieder geschieden.

Nachdem er bereits im November 2005 eine zwei Episoden umfassende Gastrolle als Rettungssanitäter in der erfolgreichen und langlebigen US-amerikanischen Krankenhausserie Emergency Room – Die Notaufnahme spielte, ist er dort mit Beginn der 13. Staffel  der Hauptbesetzung als Assistenzarzt Tony Gates beigetreten.